摘要： 采用国产弱酸型阳离子交换树脂HD-2对某厂生产的庆大霉素(GM)原料药(批号0003224)进行分离，除分离到GMC1、C2、C1a外还分离得到了Rf值与西索米星(SISO)对照品相同的次要组份；通过对该组份的1H-NMR、13C-NMR、DEPT等结构测定结果表明与SISO同质。 关键词： 庆大霉素； 西索米星； 柱层析； 结构测定 中图分类号：R978.1+2 文献标识码：A 胡小玲等[1]在对某厂庆大霉素原料药(批号：0003224)的研究中发现该原料药中除含有GMC1、C2和C1a外，还多含有一个次要组份；经TLC、HPLC测定初步认为该次要组份与西索米星(sisomicin，SISO)同质。为最后证实这一个结论，我们采用国产弱酸型阳离子交换树脂HD-2对该批号原料药进行柱层析且分离得到了该次要组份，本文报道对该次要组份的分离精制和结构测定。 1 材料 分离柱：60cm×2.5cm(玻璃制)；树脂HD-2弱酸型阳离子交换树脂；精制柱：55cm×1.5cm(玻璃制)羧甲基葡聚糖凝胶C-25(CM-sephadexC-25，AmerchamBiosciences公司出品)；自动部分收集仪BS-100A；恒流泵HL-1；旋转薄膜浓缩仪1800-Ⅰ型；硫酸庆大霉素标准品：中国药品生物制品检定所提供；硫酸庆大霉素原料药：批号0003224；硫酸西索米星对照品：无锡第二制药厂提供；硅胶G薄板(TLC)：10cm×20cm硅胶G板(展层系统：氨水-甲醇-氯仿=1∶1∶1下相)；仪器：LC-10AD(SPD-10A紫外检测仪C-R7A数据处理器和CTO-10A柱温箱)；色谱柱：Shim-packCLC-ODS，5Lm，6mm×150mm；色谱条件：依照中国药典2000年版二部附录VD测定[4]，以水-冰乙酸-甲醇(25∶5∶70)配制的0.02molL庚烷磺酸钠溶液为流动相，流速为1mLmin，检测波长为330nm；柱温为28℃；核磁共振仪型号：1NOVA-400；测定条件：D2O400mHz。 2 次要组份分离和精制 2.1 分离 处理好的HD-2树脂湿法装柱，先用1molLNH4OH洗柱，再用去离子水洗至pH8左右备用。硫酸庆大霉素样品5g溶于30mL去离子水中，上样，上样完毕后先用1L水洗，然后用0.1~0.3molLNH4OH梯度洗脱，部分收集，TLC检测，将Rf值与SISO对照品相同的组份合并，薄膜浓缩至干。 2.2 精制 将分离得到次要组份先用10mL去离子水溶解，然后再用3molLH2SO4调pH至6.0左右，用凝胶柱精制，上样后先用500ml水洗，然后再用0.05~0.2molLNH4OH梯度洗脱，分部收集，采用TLC法和HPLC法检测，合并单组份，加入20mL去离子水，经微孔滤膜过膜，冷冻干燥得到约192mg次要组份。 3 结果 3.1 TLC 该次要组份经薄层层析分析，其Rf值与SISO对照品相同；用茚三酮显影均呈黄褐色斑点(图略)。 3.2 HPLC 该次要组份经HPLC分析其保留时间为29.282min，与SISO对照品保留时间(29.252min)相同(图1)。 3.3 1H-NMRSISO的结构见图2。
次要组份的1H-NMR化学位移及其归属见表1。 1H-NMR结果表明：(1)本品在D1.145和2.729处各有一个甲基单峰，分别为4″-CH3和3″-N-CH3；(2)D4.948为一个被裂分为双峰的差向氢信号，D5.414也应为一个被裂分为双峰的差向氢信号(因J很小，图未示出裂分)，提示本品有两个糖苷键，它们的J均小于4Hz，表明为eq键(即糖苷键为A构型)；(3)本品有四个亚甲基，其中2-CH2、3′-CH2、5″-CH2的两个质子化学位移不同，处在高磁场的为ax键，低磁场的为eq键。6′-CH2的两个质子化学位移基本相同，故不处在环中。 3.4 13C-NMR和DEPT谱次要组份的13C-NMR和DEPT测定数据和化学位移及其归属见表2。
13C-NMR和DEPT谱表明：(1)本品有19个碳原子，其中有2个甲基(CH3)碳，4个亚甲基(CH2)碳及2个季碳，其余为11个次甲基碳；(2)化学位移22.478处有一个C4″-CH3，36.132处有一个C3″-NCH3；(3)DEPT图显示本品在化学位移25.091、28.905、42.121和69.156处有四个亚甲基碳，应分别属于C3′、C2、C6′和C5″；(4)13C-NMR谱和DEPT谱相对照，71.423和145.081碳信号在DEPT中消失，说明各为季碳，归属于C4″和C5′。 3.5 结论 从TLC、HPLC、13C-NMR、DEPT等分析结果表明该次要组份与SISO同质。 4 讨论 (1)郑绳一等[3]首先采用国产羧甲基葡聚糖凝胶C-25和硅胶柱层析，对我国某厂生产的庆大霉素原料药(批号78107)进行组份分离，分离得到GMC1、C2、C1a单组份，并经1H-NMR测定与国外报道的同质；龚炳永等[4]采用阴离子交换剂SA-10A(OH-)层析柱对国产庆大霉素组份进行了分离和研究，并用1H-NMR将各主组份分别鉴定为GMC1、C2、C1a，此外还分离得到一个假二糖的次要组份；缪昌城等[5]采用国产硅胶G对国产庆大霉素C族组份进行了分离，并用羧甲基葡聚糖凝胶C-25精制经1H-NMR测定其GMC1、C2、C1a纯度均可达99%以上。我们采用国产HD-2树脂进行庆大霉素次要组份的分离并获成功，这在国内尚属首次报道。 字体：大 中 小 |
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